在植物中产生多个基因的有效突变仍然是一个挑战。2月3日，来自中国农业大学的陈其军教授在《ScientificReports》发表的一项研究中，开发了一种新的用于植物CRISPR/Cas系统合成的生物学工具箱MISSA2.0。可以有效的促进两个或多个正交CRISPR/Cas9系统的植物多重基因组编辑。
使用CRISPR/Cas系统诱导多重突变需要构建多个sgRNA（单指导RNA）。由于多个sgRNAs的高效装配方法，使得两种或更多种sgRNA的高效表达已不是问题。因此，在理想的情况下，CRISPR/Cas9可以同时编辑无限数量的基因组位点。
然而，目前的情况是远非理想的：有效的基因编辑需要在核中维持sgRNA-Cas9复合物每个突变的适当浓度。而sgRNA-Cas9复合物突变的功能性浓度与sgRNA或靶位点的数量成反比。多个sgRNA在细胞中的表达会影响sgRNA-Cas9复合物突变的浓度，从而降多重基因组编辑的效率。因此，在植物中产生多个基因的有效突变仍然是一个挑战。
为了克服这一障碍，陈其军研究组建立了MISSA2.0，第二代MISSA技术的发展，具有改进的、经验证的一站式MISSA试剂，可用于有效装配两个或更多个正交CRISPR/Cas系统。
MISSA是一种可回收的、体内位点特异性DNA装配方法。在MISSA2.0中，研究人员的一个关键性改进是他们开发了一种基于质粒RK2的新型自杀供体载体系统，其具有更高的克隆能力（kb）。新的自杀供体载体系统可以更好地满足用高分子量DNA装配的要求，例如CRISPR/Cas系统。
研究人员首先将多个DNA片段装配到大肠杆菌染色体中，并通过产生组成型或诱导型过表达多个基因的拟南芥转基因植株来验证MISSA2.0这一新工具的效用。随后发现基于RK2的MISSA2.0供体载体的更高克隆能力能显著促进两个正交CRISPR/Cas系统（包括SpCas9和SaCas9）的装配，从而促进了携带两个正交CRISPR/Cas9系统的转基因品系的产生。
MISSA2.0这一工具将有助于基于两个或多个正交CRISPR/Cas9系统的植物多重基因组编辑的发展，并且还可以实现植物合成生物学的进步。
本文通讯作者是中国农业大学植物生理学与生物化学国家重点实验室的陈其军教授。他的研究方向为建立并应用植物合成生物学技术及基因组编辑技术提高植物抗逆性和营养高效性。在植物基因组编辑领域，采用卵细胞特异性启动子驱动Cas9策略，有效克服了拟南芥突变体嵌合问题，为拟南芥功能基因组研究提供了有应用价值的手段，并建立了有效的CRISPR/Cas9植物基因组编辑工具箱。
参考资料：MISSA2.0:anupdatedsyntheticbiologytoolboxforassemblyoforthogonalCRISPR/Cassystems.ScientificReports;doi:10./srep
年3月24-25日，陈其军教授将在上海“基因编辑学术研讨会”上，同国内基因编辑领域的一线专家们一起做深入探讨。如您对各位嘉宾的研究内容有任何疑问但无法到场交流，欢迎您留言给编辑，Bio将在会后的嘉宾交流环节提出，并给您邮件答复。（点击阅读原文，了解更多会议概况、嘉宾paper精要）
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